STEMCELL：如何使用STEMdiff试剂盒生成人多能干细胞hPSC来源的3D肾脏类器官

概述：

STEMdiff™ 肾脏类器官试剂盒提供了一种简易的工作流程，可利用 96 孔板或其他标准细胞培养板形式，从人 pluripotent 干细胞（hPSCs）的 2D 单层细胞诱导分化出肾脏类器官。虽然这种方法兼容高通量成像和分析检测，但它限制了类器官在悬浮状态下的培养能力，例如在多囊肾病（PKD）研究中促进囊肿形成，或将类器官包埋在基质中以进行血管化研究。

本实验方案通过对原版 STEMdiff™ 肾脏类器官试剂盒工作流程进行修改，解决了这些局限性，从而生成 3D 类器官。该过程首先进行为期 7 天的 2D 分化，使 hPSCs 达到肾祖细胞阶段。随后将细胞解离、重聚，并利用 AggreWell™ 微孔培养板进一步分化 11 天，最终形成大小和数量均一的肾脏类器官。

使用 AggreWell™ 800 等规格的培养板可大量生成 3D 肾脏类器官，每个六孔板可产出 1,500 个类器官；或者使用 AggreWell™ HT 生成较小的重复样本，每个 96 孔板可产出 32 个类器官。

图 1. 使用 STEMdiff™ 肾脏类器官试剂盒生成 3D 人类肾脏类器官培养物的工作流程示意图

此前在 mTeSR™1 培养基中维持培养的 hPSCs 在第 -3 天被接种到涂覆有 Corning® Matrigel® 的培养板中。24 小时后（第 2 天），在贴壁细胞上覆盖一层额外的 Matrigel®，这将在接下来的 48 小时内促使形成中空（cavitated）的 PSC 球体。次日（第 1 天），将培养基从 mTeSR™1 更换为 STEMdiff™ 肾脏类器官试剂盒培养基，启动中空 PSC 球体的分化程序。在接下来的 18 天内，细胞依次定向分化为晚期原条（late primitive streak），随后使用 AggreWell™ 微孔板进行重聚，最终形成 3D 肾脏类器官。

该方案始于将六孔板中的高质量 hPSCs 以单细胞形式接种到新的六孔板中（第 3 天），随后形成中空 PSC 球体（第 1 天至第 2 天），球体在第 1 天可见。

图 2. 接种后 24 小时，细胞开始形成小而分散的集落

肾脏类器官分化方案开始时，第 -2 天 (A, B) 人胚胎干细胞（hESCs；H9 细胞系）和 (C, D) 人诱导多能干细胞（hiPSCs；WLS-1C 细胞系）的形态。两种细胞系均使用 mTeSR™1 培养基以 3 x 10⁴ 个细胞/孔的密度接种于六孔板中。比例尺 = 200 µm。

图 3. 第 1 天，Matrigel 中的集落形成了小的空腔球体，准备进入肾脏类器官分化的第 1 阶段

第 1 天，成功形成空腔球体后，(A, B) hESCs（H9 细胞系）和 (C, D) hiPSCs（WLS-1C 细胞系）在 mTeSR™1 培养基中的形态。比例尺 = 200 µm。

图 4. 肾脏类器官分化过程中，诱导晚期原条阶段后第 1.5 天 hPSCs 的形态

第 1.5 天处于第 1 阶段分化期间（诱导晚期原条阶段）时，(A, B) hESCs（H9 细胞系）和 (C, D) hiPSCs（WLS-1C 细胞系）的形态。细胞将经历显著的死亡，导致部分细胞脱落和集落缩小。比例尺 = 200 µm。

图 5. 第 7 天 hPSC 来源的单层细胞形态，准备收集并重聚至 AggreWell™ 中

第 7 天准备收集并重聚前，(A, B) hESCs（H9 细胞系）和 (C, D) hiPSCs（WLS-1C 细胞系）的形态。可以观察到早期类器官结构的出现。比例尺 = 200 µm。

图 6. 第 18 天 hPSC 来源的 3D 肾脏类器官形态呈球形，内部具有卷曲的管状结构

第 18 天时 (A, B) hESC-（H9 细胞系）和 (C, D) hiPSC-（WLS-1C 细胞系）来源的 3D 肾脏类器官的明场图像。类器官从 AggreWell™ HT 微孔板中取出，置于平底 96 孔板中进行成像。比例尺 = 200 µm。

图 7. 第 18 天的 3D 肾脏类器官显示出足细胞、近端小管和远端小管的存在

第 18 天时 (A) hESC-（H9 细胞系）和 (B) hiPSC-（WLS-1C 细胞系）来源的 3D 肾脏类器官的免疫荧光图像。类器官显示出足细胞（红色）、近端小管（绿色）、远端小管（白色）和细胞核（蓝色）的标记物。比例尺 = 200 µm。

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