Polysciences 24765 线性聚乙烯亚胺(MW 40,000)说明书

一、 产品详细描述

产品全称：PEI MAX（聚乙烯亚胺“Max"），高活性线性聚合物，分子量40000道尔顿

英文原名：Polyethylenimine “Max" (PEI MAX), high potency linear

中文命名：线性聚乙烯亚胺（高活性/超纯级）

国际货号：24765

品牌归属：Polysciences Incorporated（美国 Polysciences 公司），本项目专属生物工艺子品牌 Kyfora Bio

产品规格：常见规格包括 100毫克、500毫克、1克、5克以及定制化大包装（具体规格以实际订购为准）

产品形态：本品通常以无菌过滤的水合溶液（如 1 mg/mL）或冷冻干燥粉末的形式提供，具有佳的溶解性和批次间稳定性。

分子量特征：本品为精确的 40000 道尔顿（40 kDa）线性聚合物，不含支链结构，确保了其在细胞转染和内体逃逸过程中的高效性与低毒性。

纯度与质控：生产过程严格把控，通过超滤和色谱纯化技术去除内毒素、重金属离子及小分子杂质。产品具有高的单体纯度，并经过严格的生物学功能验证，确保在敏感的真核细胞转染中不会引发非特异性的细胞应激反应或凋亡。

产地与制造：100% 美国本土制造与包装。Polysciences 位于美国宾夕法尼亚州沃灵顿（Warrington, PA）的先进cGMP合规生产基地，确保了全球供应链的稳定性，有效规避了因跨国物流扰动、关税政策变动或地缘政治因素导致的交货延期及额外附加费用。

应用领域标签：本产品属于 Kyfora Bio 品牌重点推广的高性能生物工艺试剂，专为满足现代细胞与基因治疗（CGT）、重组蛋白大规模生产、以及各类病毒载体（如 AAV、慢病毒）包装的严苛需求而设计，是连接基础研究与临床级生物制药的关键桥梁。

二、 产品核心特点与优势

PEI MAX 被广泛认为是当前体外（in vitro）与体内（in vivo）转染实验中具价值且性价比高的金标准试剂之一。其性能源于以下几个核心特点：

首先，独特的分子结构与高缓冲能力。PEI MAX 的分子骨架上具有高密度的可质子化氨基基团，其主链上每隔三个原子即为一个氨基氮原子。这种特殊的结构赋予了 PEI MAX 在任何近乎生理或酸性 pH 环境下的缓冲能力（即著名的“质子海绵效应"）。

其次，高效的基因载荷递送与释放机制。一旦 PEI MAX 与遗传材料（如质粒 DNA、siRNA 或 CRISPR 复合物）形成纳米颗粒并被细胞内吞，其质子缓冲能力会导致内体（Endosome）内部渗透压剧增，最终致使内体膜破裂，将包裹的遗传物质安全释放到细胞质中，极大提高了转染效率。

第三，广泛的细胞类型兼容性。PEI MAX 能够与多种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）发生强效相互作用，从而被细胞高效摄取。它不仅适用于贴壁培养的常规细胞系，更在悬浮培养的工业级细胞系（如 HEK293 和 CHO 细胞）中表现出极其优异的转染效率，且不会像许多市售脂质体转染试剂那样引起严重的细胞毒性或 viability 下降。

第四，经济性与可放大性。相较于动辄数千元且难以在悬浮细胞中发挥作用的进口脂质体试剂，PEI MAX 不仅单次转染成本低廉，而且其化学合成的可控性高，批次间差异极小。这使得研究人员能够从实验室级别的微量筛选（96孔板）无缝放大至摇瓶、生物反应器乃至千升级的大规模发酵罐，而无需重新优化转染条件。

最后，优异的实验数据支撑。以重组腺相关病毒（rAAV）的生产为例，使用 PEI MAX 在 HEK293 悬浮细胞中进行三重质粒共转染，能够在转染后 72 小时内收获到高滴度的 rAAV 病毒颗粒。随着培养时间的推移，上清液中的病毒载体产量会持续攀升，充分证明了该试剂在维持细胞健康状态及促进外源基因持续表达方面的双重优势。

三、 作用机理深度解析

聚乙烯亚胺（PEI）作为一种经典的阳离子聚合物，其介导基因转染的过程是一个精妙的物理化学与细胞生物学协同作用的结果。这一过程可以详细拆解为以下四个关键步骤：

第一步，静电复合物的自发形成。由于质粒 DNA 带有强烈的负电荷（磷酸骨架），而 PEI MAX 在水溶液中带有大量的正电荷（质子化的氨基）。当两者混合时，正负电荷相互吸引，PEI 能够迅速中和 DNA 的电荷，并通过熵驱动效应自发组装成粒径均一的纳米级复合物（Polyplexes）。这种复合物能够保护 DNA 免受细胞外环境中核酸酶的降解。

第二步，细胞表面吸附与内吞作用。细胞膜表面富含带负电的糖胺聚糖（如硫酸乙酰肝素），PEI-DNA 复合物凭借其整体的正电荷，能够高效地吸附在细胞膜上。这种静电吸附会触发细胞膜的局部弯曲，通过网格蛋白介导或非依赖型的内吞作用（Clathrin-mediated endocytosis / Macropinocytosis）将复合物包裹进入细胞内部，形成内体（Endosome）。

第三步，内体逃逸（Endosomal Escape）——“质子海绵效应"。这是 PEI MAX 区别于其他转染试剂最核心的机制。在内体的酸性环境（pH 5.0 - 6.5）下，PEI 分子上的氨基大量质子化，使其成为一个近乎不可穿透的“质子海绵"。这不仅阻断了内体向溶酶体的成熟融合，还会导致氯离子和水分子大量涌入内体，引发内体肿胀并破裂。借此物理力量，PEI-DNA 复合物得以逃离降解性的溶酶体，安全地进入细胞质基质。

第四步，胞质转运与核内递送。进入细胞质后，PEI 的亲水性使其能够避免聚集，并利用微管网络进行逆向运输，直达细胞核周围。在细胞分裂期（有丝分裂），核膜发生破裂与重建，此时 PEI-DNA 复合物便能顺理成章地进入细胞核内，并在还原剂（如谷胱甘肽）的作用下解离，释放出游离的质粒 DNA，从而启动高水平的基因转录与蛋白表达。

四、 解决的核心实验痛点

在现代生命科学研究与生物制药开发中，科研人员经常面临基因递送效率低下或细胞状态受损的困境。PEI MAX 的出现，精准解决了以下几大长期存在的实验痛点：

第一，替代传统磷酸钙法带来的不可控性。传统的磷酸钙共沉淀法虽然成本低，但其对 pH 值、温度和缓冲液成分极度敏感，极易形成大颗粒沉淀导致细胞严重脱落死亡，且转染效率波动极大。PEI MAX 形成的纳米复合物均匀稳定，避免了金属离子沉淀对细胞的物理损伤，大幅提升了实验的可重复性。

第二，弥补脂质体试剂在工业级悬浮细胞中的短板。市面上绝大多数商业化的脂质体转染试剂（如 Lipofectamine 2000/3000）主要针对贴壁细胞优化，不仅价格极其昂贵，而且在 HEK293 或 CHO 悬浮细胞中要么效率极低，要么展现出强的细胞毒性，导致细胞活率断崖式下跌。PEI MAX 对悬浮细胞异常友好，即使在无血清的悬浮培养基中也能保持高的细胞活率和转染效率。

第三，突破病毒载体包装的滴度瓶颈。在 AAV 或慢病毒包装过程中，辅助质粒（Helper plasmid）和功能质粒的高水平共表达至关重要。普通转染试剂往往因为细胞毒性导致培养 48 小时后细胞大面积死亡，从而限制了病毒产量的积累。PEI MAX 温和的作用机制允许细胞在转然后继续保持旺盛的代谢活性，使得病毒抗原的表达和组装能够持续进行 72 小时甚至更久，从而获得超高滴度的病毒原液。

第四，消除批次差异带来的工艺放大障碍。许多生物来源的转染试剂（如某些病毒载体或重组蛋白因子）存在不可避免的批次间差异。而 PEI MAX 作为纯化学合成的聚合物，其分子量分布（PDI）和官能团密度受到严格质控，确保了从实验室毫克级到工厂公斤级的绝对线性放大，为基因治疗的临床前研究及 IND 申报提供了坚实的物料基础。

五、 储存条件与运输规范

为了保证 PEI MAX 的最佳生物活性及延长使用寿命，正确的储存与运输条件至关重要。

运输条件：本品在运输过程中需使用冰袋或干冰进行冷链运输，以防止高温导致聚合物降解或氧化变色。

短期储存（日常使用）：收到产品后，建议将其分装为若干小管（例如按每次实验的用量分装），置于 2°C 至 8°C 的冰箱中避光保存。在此条件下，产品可保持稳定长达 6 个月至 1 年。

长期储存：若预计长时间不使用，应将产品密封存放于 -20°C 的低温冰箱中。冷冻保存可维持产品理化性质和生物活性长达 2 年以上。

关键禁忌：

1. 严禁反复冻融。多次冻融会破坏高分子链的完整性，导致分子量降低，从而严重影响转染效率。务必进行小份分装后再冷冻。

2. 防止微生物污染。由于 PEI MAX 通常以水溶液形式存在，极易成为细菌滋生的温床。操作时必须在无菌环境（如超净工作台）下进行，使用前后需对瓶盖及分装容器口进行火焰灼烧或酒精擦拭消毒。

3. 避免光照与高温。长时间暴露于强光或高于 25°C 的环境会导致产品氧化变黄，活性下降。如发现溶液颜色明显变深（呈琥珀色或棕色），说明产品已部分失效，不建议继续用于珍贵样本的转染。

六、 适用范围与主要应用场景

得益于其广泛的兼容性和高效率，PEI MAX 已成为众多前沿生物技术领域的通用型工具试剂：

1. 瞬时蛋白表达系统：在 HEK293 或 CHO 细胞中瞬时转染含有目标蛋白基因的质粒，可在 3-5 天内获得毫克至克级别的高纯度重组蛋白，广泛用于抗体生产、酶制剂制备及结构生物学研究。

2. 病毒载体包装与生产：这是 PEI MAX 目前应用最为广泛的领域。无论是用于基因治疗的腺相关病毒（AAV 各种血清型如 AAV2/5/8/9 等）、慢病毒（Lentivirus）、还是逆转录病毒（Retrovirus），PEI MAX 都能提供包装效率。特别是在悬浮细胞无血清培养体系中，它更是大规模病毒生产的优选转染试剂。

3. 稳定细胞系构建（Pool 筛选）：通过转染含有抗性基因（如嘌呤霉素、杀稻瘟菌素）的表达载体，利用 PEI MAX 的高效递送能力，可以快速建立稳定过表达或基因敲除的细胞池（Polyclonal pool），大幅缩短药物筛选的周期。

4. CRISPR/Cas9 基因编辑递送：可将编码 Cas9 蛋白的 mRNA 或质粒，连同 sgRNA 表达框，共同封装进 PEI 复合物中，实现高效率的基因敲除、敲入或单碱基编辑。

5. 体内（In Vivo）基因治疗研究：经特殊纯化的 PEI MAX 可用于小动物（如小鼠、大鼠）的器官靶向转染（如尾静脉注射靶向肝脏），其良好的生物相容性和低免疫原性使其成为非病毒载体基因治疗的有力候选材料。

七、 详细使用方法与标准操作流程 (SOP)

为了获得最佳的转染效果，我们强烈建议用户在使用该产品时，针对特定的细胞类型和质粒组合进行一次矩阵滴定实验（Matrix Titration），以确定最佳的 DNA 与 PEI 质量比（通常范围为 1:2 到 1:6）。以下是基于 30 mL 悬浮 HEK293 细胞（密度为 1×10^6 cells/mL）进行 rAAV 包装的标准操作流程示例：

A. 转染前细胞准备

在转染当天，将处于对数生长期的 HEK293 悬浮细胞计数。以 1×10^6 cells/mL 的密度接种 30 mL 细胞到 125 mL 摇瓶中。确保细胞活率（Viability）在转染前高于 95%。将摇瓶置于 37°C、5% CO2、湿度饱和的培养箱中，以 120-150 rpm 的转速振荡培养。

B. 质粒 DNA 的准备与质量控制

高质量的质粒是高效转染的前提。必须使用内毒素含量极低（< 0.1 EU/μg）的商业化去内毒素质粒提取试剂盒（如 Qiagen Plasmid Plus Maxi Kit）抽提用于转染的质粒。将三种 AAV 包装质粒（pAAV-CMV-eGFP, pRepCap8, pHelper）等比例混合，总质量为 30 μg（即每种质粒 10 μg）。将混合好的质粒加入 1.5 mL 无菌 EP 管中，补足 Opti-MEM 或 PBS 至总体积为 500 μL，轻轻混匀。

C. PEI MAX 稀释液的配制

根据预设的 DNA:PEI 质量比（例如 1:3），称取或吸取相应量的 PEI MAX 溶液。在本例中，30 μg DNA 需要 90 μg PEI MAX。将 PEI MAX 加入到另一个含有 500 μL Opti-MEM 或 PBS 的无菌 EP 管中，轻轻弹击管壁混匀。

D. 转染复合物（Polyplexes）的孵育形成

将稀释好的 PEI MAX 溶液逐滴加入到质粒 DNA 稀释液中。加完后，用移液器轻轻吹打 3-5 次混匀（切忌用力涡旋震荡，以免产生过多泡沫或破坏 DNA 结构）。将混合物在室温下静置孵育 15-20 分钟。期间，PEI 与 DNA 会自组装形成粒径约为 50-200 nm 的阳性纳米复合物。

E. 复合物添加与培养

将孵育好的 1 mL PEI-DNA 复合物均匀地逐滴加入到 30 mL 细胞培养液中。加完后，轻轻晃动摇瓶或将摇瓶放回摇床，以 120-150 rpm 的速度继续培养。

注意：对于极其敏感的细胞系，也可在加入复合物 4-6 小时后，更换一次新鲜预热的培养基，以进一步降低聚合物对细胞的长期毒性。

F. 转染效率监测与产物收获

转染后 24 小时，可取样在荧光显微镜下观察报告基因（如 eGFP）的表达情况，评估转染效率。对于 rAAV 生产，通常在转染后 48 小时和 72 小时分别取样检测上清液中的病毒滴度。你会发现随着时间推移，培养基中的功能性病毒颗粒数量会显著增加。

八、 常见问题与解决方案 (Troubleshooting)

在实际实验操作中，由于细胞状态、质粒质量或操作细节的差异，可能会遇到各种技术问题。以下是我们整理的关于 PEI MAX 使用过程中最高频的 20 个问题及其对应的深度解决方案：

问题 1：转染效率极低，甚至几乎检测不到目标蛋白或荧光信号？

解答：导致此问题的原因通常有以下几点。首先，检查质粒 DNA 的纯度。残留的内毒素会严重抑制细胞转染和后续基因表达，务必使用去内毒素质粒提取试剂盒重新制备高纯度 DNA。其次，可能是 PEI 与 DNA 的比例不合适。不同细胞系对 N/P 比的耐受度不同，建议进行 1:2 至 1:6 的梯度优化。此外，复合物孵育时间不足或过长也会影响效率，请严格控制室温下 15-20 分钟的孵育窗口。最后，确认细胞密度是否过高或过低，最佳转染密度通常为汇合度 70%-90%（贴壁）或 1×10^6 cells/mL（悬浮）。

问题 2：转染后细胞大量死亡，活率急剧下降甚至脱落？

解答：细胞毒性过大通常是因为 PEI 用量超标或细胞状态不佳。请降低 DNA 与 PEI 的质量比（例如从 1:4 降至 1:2）。另外，检查是否使用了正确的 PEI 规格，本品为 40 kDa 线性 PEI，若误用高分子量（如 750 kDa）支化 PEI 则毒性强。同时，确保转染时细胞处于佳的对数生长期，老化的细胞对内吞作用产生的应激更为敏感。对于特别敏感的细胞，可在加药 4-6 小时后更换新鲜培养基。

问题 3：形成的 PEI-DNA 复合物出现肉眼可见的大块沉淀或浑浊？

解答：这通常是由于稀释液离子强度过高或 pH 值不适引起的。配置复合物时，必须使用低离子强度的缓冲液（如 Opti-MEM、PBS 或无血清基础培养基），切勿直接在含血清的培养基中混合。同时，确保两种稀释液在混合前达到室温。轻柔的混合方式也很重要，剧烈涡旋会导致聚合物聚集。

问题 4：在悬浮细胞中转染效果不佳，细胞容易结团抱团？

解答：悬浮细胞结团会影响物质交换和氧传递，从而降低转染效率。这可能是由于复合物带有过强正电荷导致的细胞聚集。尝试提高质粒 DNA 的用量或微调 PEI 比例，以找到等电点附近的黄金配比。另外，确保摇床转速均匀，培养环境湿度适宜，防止培养基蒸发导致局部离子浓度过高。

问题 5：包装出的病毒滴度远低于文献报道或预期值？

解答：除了优化 PEI 比例外，还需关注质粒的配比。在 AAV 或慢病毒包装中，三种质粒（转移质粒、辅助质粒、包装质粒）的比例并非一定是 1:1:1，可根据具体血清型尝试 1:1:2 或其他比例。此外，细胞密度是关键，过高的密度会导致营养快速耗竭，建议在转染时将细胞密度控制在 0.8 - 1.2 × 10^6 cells/mL 之间。

问题 6：荧光观察时，只有少数细胞发光，且发光强度较弱？

解答：这反映了质粒进入细胞但未能有效表达。除了上述的内毒素问题外，还可能与启动子选择有关。确保所用的启动子（如 CMV, EF1α）与目标细胞系兼容。另外，PEI 复合物的粒径如果过大，会影响其从细胞质到细胞核的转运效率，可适当延长复合物孵育时间至 25 分钟，或轻微提高 PEI 用量以增强质子海绵效应。

问题 7：进行体内（In Vivo）注射时，发现 PEI 溶液有刺激性或引起动物死亡？

解答：本品主要为体外（In Vitro）细胞培养设计。若用于体内实验，普通的 PEI 溶液可能含有微量有机溶剂或缓冲盐，直接注射会引起炎症反应。如果必须进行体内转染，建议购买专门经过超滤除盐、内毒素去除及无菌过滤的 In Vivo Grade PEI MAX，并严格控制注射体积和浓度。

问题 8：冻存的 PEI MAX 溶液解冻后出现絮状物或沉淀？

解答：这是由于反复冻融导致的聚合物链断裂和聚集。PEI 水溶液在冷冻过程中会发生相分离，破坏其原有的溶解状态。一旦出现异常沉淀，该批次试剂的转染效率将大打折扣，不建议继续使用。请务必将大包装产品分装成单次使用的小份（如 50 μL/管）后再进行冷冻保存。

问题 9：贴壁细胞转染时，培养基中的血清是否会干扰 PEI 的作用？

解答：与脂质体类转染试剂不同，PEI MAX 对血清的耐受性相对较好。在许多细胞系中，可以直接在有血清的培养基中加入 PEI-DNA 复合物而不影响最终效率。但为了转染效果，对于初次测试的细胞系，仍建议参照说明书，在无血清条件下孵育复合物，或在转染 4-6 小时后换液。

问题 10：如何计算不同培养规模下的 PEI 用量？

解答：PEI 的用量具有很好的线性放大特性。基本原则是保持终浓度一致。例如，在 1 mL 培养基中最佳 PEI 浓度为 3 μg/mL，那么在扩大到 1 L（1000 mL）培养体系时，所需添加的 PEI MAX 量即为 3 mg。只需保证混合时的稀释倍数相当即可。

问题 11：使用 PEI MAX 转染 siRNA 或 miRNA 的效果如何？

解答：PEI MAX 同样可以用于小核酸分子的递送。但由于 siRNA 分子量远小于质粒 DNA，所需的 PEI 氮磷比（N/P ratio）会有所不同。通常需要更高的 N/P 比（如 10:1 到 20:1）来实现有效包封。建议参考专业文献中的计算公式进行 siRNA 转染条件的优化。

问题 12：转染后的细胞培养上清变得浑浊或有漂浮物？

解答：这可能是由于细胞碎片增多（转染毒性导致）或培养基中蛋白质成分析出。建议转染后在倒置显微镜下观察细胞形态，如果细胞轮廓依然清晰且贴壁良好，通常不影响最终目的产物的收获。若进行病毒收集，可通过低速离心（如 300 × g，5 分钟）去除细胞碎片，再用 0.45 μm 滤器过滤澄清。

问题 13：能否用 PBS 代替 Opti-MEM 稀释 PEI 和 DNA？

解答：可以。PBS（磷酸盐缓冲液）由于其稳定的离子强度和 pH 值，是非常优秀的稀释液。但需注意，PBS 中的二价阳离子（如 Mg2+、Ca2+）可能会与 PEI 发生微弱相互作用，因此推荐使用不含二价阳离子的 PBS 配方。Opti-MEM 因其成分明确且含有必要营养，通常是优选。

问题 14：如何判断购买的 PEI MAX 是否变质失效？

解答：最直观的判断方法是观察颜色。新鲜的 PEI MAX 溶液应为无色透明或极淡的黄色。如果溶液变为明显的深黄色、橙色甚至棕色，说明聚合物已被氧化，氨基减少，转染能力显著下降。此外，若溶液出现不可溶解的胶状物质，也表明产品变质。

问题 15：在 96 孔板等高通量板中进行转染，需要注意什么？

解答：小规模高通量筛选时，由于表面积体积比大，边缘孔的水分蒸发更快，容易导致局部浓度变化。建议使用带有低挥发盖的专用细胞培养板，或在培养箱中加入水盘保持湿度。混合复合物时，可使用多通道移液器或自动化液体处理工作站，确保加样的精确性和一致性。

问题 16：为什么我的细胞在转染后生长停滞了？

解答：外源基因的过量表达会给细胞带来极大的代谢负担。特别是包装病毒时，大量病毒蛋白的合成会占据细胞的内质网和高尔基体，引发未折叠蛋白反应（UPR），从而导致细胞周期停滞。这是正常现象，通常在更换新鲜培养基后 24 小时内恢复。若停滞时间过长，需降低 DNA 转入量。

问题 17：PEI MAX 是否适用于原代细胞（Primary Cells）转染？

解答：原代细胞（如神经元、心肌细胞、原代肝细胞）通常分裂缓慢且对外源物质极为敏感。常规的 40 kDa 线性 PEI 在原代细胞上的毒性可能偏高。若需转染原代细胞，建议降低 PEI 浓度，缩短复合物与作用细胞的接触时间（如 4 小时后换液），或寻找专门针对原代细胞优化的低分子量 PEI 衍生物。

问题 18：进行 CRISPR 基因编辑时，使用 PEI MAX 递送质粒的效率如何？

解答：PEI MAX 非常适合于递送 CRISPR/Cas9 质粒进行基因敲除。为了提高编辑效率，建议与电穿孔（Electroporation）方法做对比。在较难电转的细胞系中，PEI 介导的转染由于操作温和，能更好地保持细胞活率，虽然单挑效率可能略低，但在 pooled 筛选中能提供更均匀的基因干扰效果。

问题 19：大规模生物反应器中使用 PEI MAX 有什么特别要求？

解答：在 Wave 袋或搅拌釜反应器中放大时，关键在于确保 PEI-DNA 复合物的均匀分布。由于大规模下难以手动逐滴加入，通常需要预先在单独的容器中混合孵育好复合物，然后用蠕动泵在数分钟内均匀泵入主反应罐。同时，需密切监控反应器的溶氧（DO）和 pH 值，因为大量细胞转染后代谢可能会发生突变。

问题 20：废弃的 PEI MAX 溶液或转染废液应如何处理？

解答：PEI MAX 属于高分子有机聚合物，具有一定的生物累积性。未使用完的过期试剂或接触过细胞的废液，不得随意倒入下水道。应按照实验室危险化学品废弃物处理规定，收集在专用的废液桶中，由具备资质的第三方环保公司定期回收处置。

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